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吸光度法測定酶的催化活性

基本的考慮因素。由于吸光度法技術上簡單可靠,所用儀器價格合理,因此是目前酶活 測定中首選的方法之一。 當底物或產物是有顏色的,或者是在紫外區有光吸收的,吸光度法就可以非常快速和方 便地進行,因為吸光產物的出現速率或者消失速率可以用分光光度法來跟蹤檢測。 催化活性z 對應于每分鐘的吸光度的變化為: z=(△AV³100)/ε d△t 式中,V 是測量體積,L;t 是時間,min;z 的單位是mol/min,對英語前面章節里給出的國 際單位制U 的定義。

吸光光度法是基于物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法,包括比色法、可見及紫外吸光光度法及紅外光譜法。吸光光度法是采用分光器獲得純度較高的單色光,基于物質對單色光的選擇性吸收測定物質組分的分析方法。

吸光光度法的方法原理
吸光光度法是借助分光光度計測定溶液的吸光度,根據朗伯一比耳定律確定物質溶液的濃度。吸光光度法是比較有色溶液對某一波長光的吸收情況。

吸光光度法的特點
A靈敏度高
一般吸光光度法所測定的下限可達10-5~10-6mol/L,因而有較高的靈敏度,適用于微量組分的分析。
B準確度較高
吸光光度法的相對誤差為2%~5%,采用精密的分光光度計測量,相對誤差為1%~2%,其準確度雖不如滴定分析法高,但已滿足微量組分測定的準確度要求,而對微量組分的測定,滴定分析法是難以進行的。
C簡便、快速
吸光光度法所使用的儀器——分光光度計,操作簡單,易于掌握。近年來,由于一些靈敏度高、選擇性好的顯色劑和各種掩飾不斷出現,常可不經分離直接進行吸光度分析,有效地簡化了測量步驟,提高了分析速度。
D應用廣泛
幾乎所有的無機物和許多有機化合物都可直接或間接地用吸光光度法進行測定。從外,該法還可用來研究化學反應的機理,以及溶液的化學平衡等理論。如測定配合物的組成,弱酸、弱堿的理解常數等。由于有機試劑和配位化學的迅速發展及分光光度計性能的提高。吸光光度法已廣泛用于生產和科研部門。

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吸光度測定方法
1、單一組分的測定
①比較法。比較法是先配制與被測試液濃度相近的標準溶液c(S)、被測試液c(X),在相同條件下顯色、定容后,測其相應的吸光度為A和A(X),根據朗伯一比耳定律:
A(S)=ε(S)b(S)c(S) A(X)=ε(X)b(X)c(X)
由于同一物質,用同一波長及相同厚度的吸收皿測定
ε(X)=ε(S) b(X)=b(S)
所以 A(S):A(X)=c(S):c(X)
即可求出待測試液的含量c(X)。
 
應當注意,進行計算時,只有當與相近時,結果才可靠,否則將有較大誤差
吸光光度法的特點是:因入射光是純度較高的單色光,故使偏離朗伯一比耳定律的情況大為減少,標準曲線直線部分的范圍更大,分析結果的準確度較高。因可任意選取某種波長的單色光,故利用吸光度的加和性,可同時測定溶液中兩種或兩種以上的組分。由于入射光的波長范圍擴大了,許多無色物質,只要它們在紫外或紅外光區域內有吸收峰,都可以用吸光光度法進行測定。
②標準曲線法
2、高含量組分的測定——示差法
3、多組分的分析

 

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