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熒光光度法測定酶的催化活性

熒光光度法測定酶的催化活性,此方法很少用于粗酶或者是純酶制備中催化活性的檢測。由于它具有很高的靈敏度,可以用于器官或者組織區域的微量酶的測定。 總體上,這種方法的靈敏度是吸光光度法的1000 多倍。主要用于對經光源激發后產生熒光的物質或經化學處理后產生熒光的物質成份分析,可應用于生物化學、生物醫學、環境化工等部門。

熒光光度法和分光光度法有什么不同?

實際上分光光度計的概念較多,分光光度計還有紫外分光光度計,紅外分光光度計等叫法.其主要是根據能量躍遷原理來區分.
例如紫外分光光度計是測量物質經過紫外激發后物質可以吸收紫外光多少,測量的值是通過物質的光,檢測信號與發射信號在一條直線上.
熒光分光光度計是給與一個激發波長后,到達激發態,再發射光,所以檢測的是物質發射的光,檢測信號與發射器不在一條線上.
例如蛋白質,因為里面有酪氨酸、色氨酸的發色基團,一般的聯苯結構,也就是可以形成ππ共軛體系的物質都可發射熒光.如果物質自身不帶有熒光,則可以加入熒光探針.熒光分光光度計

熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發光譜、發射光譜以及熒光強度、量子產率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數,從各個角度反映了分子的成鍵和結構情況。通過對這些參數的測定, 不但可以做一般的定量分析, 而且還可以推斷分子在各種環境下的構象變化, 從而闡明分子結構與功能之間的關系。熒光分光光度計的激發波長掃描范圍一般是190~650nm,發射波長掃描范圍是200~800nm。可用于液體、固體樣品(如凝膠條)的光譜掃描。

熒光分光光度計的種類:可分為單光束式熒光分光光度計和雙光束式熒光分光光度計兩大系列。

熒光分光光度計的發展經歷了手控式熒光分光光度計,自動記錄式熒光分光光度計,計算機控制式熒光分光光度計三個階段;其他的還有低溫激光Sh p ol’skill熒光分光光度計,配有壽命和相分辯測定的熒光分光光度計等。

熒光分光光度計的構成

1. 光源:
為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈,后者能發射出強度較大的連續光譜,且在300nm~400nm 范圍內強度幾乎相等,故較常用。
2.激發單色器:
置于光源和樣品室之間的為激發單色器或第一單色器,篩選出特定的激發光譜。
3.發射單色器:
置于樣品室和檢測器之間的為發射單色器或第二單色器,常采用光柵為單色器。篩選出特定的發射光譜。
4. 樣品室:
通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。測量液體時,光源與檢測器成直角安排;測量固體時,光源與檢測器成銳角安排。
5. 檢測器:
一般用光電管或光電倍增管作檢測器。可將光信號放大并轉為電信號。

熒光分光光度計的基本原理

由高壓汞燈或氙燈發出的紫外光和藍紫光經濾光片照射到樣品池中,激發樣品中的熒光物質發出熒光,熒光經過濾過和反射后,被光電倍增管所接受,然后以圖或數字的形式顯示出來。
物質熒光的產生是由在通常狀況下處于基態的物質分子吸收激發光后變為激發態, 這些處于激發態的分子是不穩定的,在返回基態的過程中將一部分的能量又以光的形式放出,從而產生熒光.
不同物質由于分子結構的不同,其激發態能級的分布具有各自不同的特征,這種特征反映在熒光上表現為各種物質都有其特征熒光激發和發射光譜;,因此可以用熒光激發和發射光譜的不同來定性地進行物質的鑒定。
在溶液中,當熒光物質的濃度較低時,其熒光強度與該物質的濃度通常有良好的正比關系,即IF=KC,利用這種關系可以進行熒光物質的定量分析,與紫外-可見分光光度法類似,熒光分析通常也采用標準曲線法進行。

熒光分光光度計的功能特點

1. 熒光發射光譜
選擇某一固定波長的光激發樣品,記錄樣品中產生的熒光發射強度與發射波長間的函數關系,即得熒光發射光譜。
2. 熒光激發光譜
選定某一熒光發射波長記錄熒光發射強度作為激發光波長的函數,即得熒光激發光譜。
3.時間分辨技術;
可用于對混合物中光譜重疊但有壽命差異的組分進行分辨并分別測量。
時間分辨熒光測定公式如下:
P(t) = P0 EXP (-t /τ)
式中P(t):擬合指數函數
P0:強度取值
EXP:指數運算符
t:時間取值
τ:熒光平均時間壽命

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