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發光法測定酶的催化活性

發光法測定酶的催化活性,發光法應用熒光、磷光以及化學發光等作為檢測器體系。活的生物體中觀察的化學放 光稱作生物體發光。生物體發光是由成為熒光素酶的酶類催化產生的,這類酶的底物即蟲熒 光素,被轉化為發光產物。

在發光法中,單位時間內反應體系發射的光子數目可以由特殊設 計的儀器——照度計來測量,這類儀器是以單光子探測器為基礎的,通常是光電倍增管。 由來源于螢火蟲的熒光素酶催化的反應就是一個例子,螢火蟲熒光素4-單加氧酶(ATP 水解酶) ATP+D-蟲熒光素+O2→氧合蟲熒光素+AMP+pp+CO2+0.9hν 在該反應中,ATP 作為底物被消耗掉,光子在 562nm 的波長處發射。每摩爾的蟲熒光 素的量子產量是0.9 愛因斯坦,也即消耗掉一分子ATP,大約發射1 個光子。因此該反應適 合用來測定ATP,從而測定那些能夠催化ATP 消耗或者是ATP 生產的反應的那些酶。 為借助于螢火蟲的生物發光來檢測酶的活性,光強度必須在幾分鐘內呈線性增加,而且 必須嚴格正比于酶的催化活性。這些測定條件在測定肌酸激酶的催化活性時,已經得到了實 現。 磷酸肌酸+ADP→肌氨酸+ATP 其他依賴于NAD(P)的反應可以通過來源于發光細菌的生物發光來跟蹤檢測。

過氧化物酶(POD)活性的測定 —愈創木酚法

一、實驗原理 過氧化物酶催化過氧化氫氧化酚類的反 應,產物為醌類化合物。 實驗以愈創木酚為過氧化物酶的底物。 在此酶存在下,H2O2 將愈創木酚氧化生成 茶褐色產物。此產物在470nm 有最大光吸 收,故可通過470nm處的吸光度變化測定過 氧化物酶的活性。

二、材料和設備

1、材料 :馬鈴薯塊莖 2、儀器設備:751 型分光光度計、離心機、研 缽、25ml 容量瓶、量筒、試管、吸量管。 3、試劑:0.05ml/L愈創木酚溶液, 0.05ml/L的磷酸緩沖液(pH5.5), 2%H2O2, 0.1mol/L兒茶酚溶液, 20%三氯乙酸溶液

三、實驗步驟

1、酶液的制備 取5.0g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖,切碎,放 入研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻 漿。將勻漿液全部轉入離心管中,于3000g 水中離心10min,上清液轉入25ml 容量瓶 中。沉淀用5ml磷酸緩沖液再提取2次,上 清液并入容量瓶中,定容至刻度,低溫下 保存備用。 2、過氧化物酶活性的測定 酶活性測定的反應體系包括:2.9ml 0.05mol/L磷酸緩沖液、1.0ml 2%H2O2、 1.0ml 0.05mol/L 愈創木酚和0.1ml酶液。 以在沸水中加熱5min的酶液為對 照,做二組重復實驗。反應體系加入酶液 后,立即于37℃水浴中保溫15min,然后迅 速轉入冰浴中,并加入2.0ml 20%三氯乙 酸終止反應。然后,過濾(或5000g 離心 10min),濾液適當稀釋,用751型分光光度 計在470nm波長下測定反應體系的吸光度。

四、實驗結果

以每min內A470變化0.01為1個過氧化物酶活力單位 酶活力=——× D △A 0.01t 酶的比活力=——× D △A 0.01Wt 式中, △A為反應時間內吸光度的變化;W為馬鈴 薯鮮重(g);t為反應時間(min);D為稀釋倍數, 即提取的總酶液為反應系統內酶液的倍數 CAT過氧化氫酶活性測定方法 過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)又名 觸酶(Catalase,CAT),是一類以鐵卟琳為 輔基的結合酶,由4個亞基組成,分子量為 240 000。存在于動植物組織與細胞中的氧 化還原酶類,它專一性地將細胞代謝產生 的過氧化氫分解成H2O和02,避免了H202在體 內積累,從而可維持體內正常的活性氧水 平。是最早發現的與種子活力有關的氧化 酶類之一.

過氧化氫酶的應用: 被用于食品包裝,防止食物被氧化。 在紡織工業中,被用于除去紡織物上的過氧化氫,以保證成品是不含 過氧化物的。 它還被用在隱形眼鏡的清潔上:眼鏡在含有過氧化氫的清潔劑中浸泡 后,使用前再用過氧化氫酶除去殘留的過氧化氫。

近年來,過氧化氫酶開始使用在美容業中。一些面部護理中加入了該 酶和過氧化氫,目的是增加表皮上層的細胞氧量。 植物細胞中的過氧化物酶體參與了光呼吸(利用氧氣并生成二氧化碳) 和共生性氮固定(將氮氣(N2)解離為活性氮原子)。細胞被病原體 感染時,過氧化氫可以被用作一種有效的抗微生物試劑。 其活性也與糧食品質之間有一定的相關性,是一項衡量谷物品質的 重要指標。

酶制劑相關產品如下:

酶制劑

因 酶制劑產品眾多,如:過氧化氫酶 粉末、α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶 、尿酸酶、輔酶A、抑肽酶、胰凝乳蛋白酶、乙酰膽堿酯酶、彈性蛋白酶、膽固醇氧化酶 、超氧化物歧化酶、腸激酶、膽紅素氧化酶、嘌呤核苷磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、凝血酶、心肌黃酶、磷酸葡萄糖變位酶、己糖激酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖 -6-磷酸脫氫酶、腺苷脫氨酶、核糖核酸酶、黃嘌呤氧化酶、溶菌酶等,詳情進入酶制劑產品頁

 

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