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抗壞血酸過氧化物酶活性測定

在茶葉中 實驗原理 APX(抗壞血酸過氧化物酶)催化AsA與H2O2 反應而使H2O2:2AsA+ H2O2→2MD-AsA( 單脫氫抗 壞血酸)+2H2O。

抗壞血酸過氧化物酶是以抗壞血 酸為電子供體的,APX首先與H2O2形成中間復合 物,中間復合物接著氧化AsA形成產物,當AsA未 被復合物利用時,APX失活。只要AsA能夠再生, APX就能充分進行催化反應,從而保護葉綠體維持 正常的光合能力。 APX酶液的制備 稱取0.5g的茶樹鮮葉剪碎,加入適量 的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液,在冰浴 中充分研磨,離心(10000g、4℃、20min) 取上層清夜1mL,分裝于小離心管中置于 4℃備用或-20℃保存。

APX活性的測定

提取液:50mmol/LPBS(磷酸氫二鉀-磷酸二 氫鉀緩沖液),pH7.8;2mmol/L AsA; 5mmol/L EDTA。 反應液:50mmol/LPBS,pH7.0;0.5mmol/L AsA;0.1 mmol/L EDTA。 在三個比色皿中各加入20? L鮮葉APX粗酶液, 再加入3mL反應液;1號比色皿中不加AsA和 H2O2啟動反應;每10s連續記錄室溫下290nm 吸光值的變化X。室溫下每一分鐘氧化 1? molAsA的酶量作為一個酶活性單位(U)。

計算公式

每克鮮葉APX的酶活性U= (X×7.5×1000×60×1000)/ (m×2.8×20×10) 上式中,X:OD值的變化;7.5:每克材料 提取7.5mL粗酶液;1000:將ml轉化成?L; 60:將1min轉化成60s;1000:將mmol轉化 成?mol;m:鮮葉的重量,單位為g;2.8: 吸光系數mmol/L cm;20:用20?L酶液進行 活性測定;10:每10s記錄吸光值的變化。 測定茶樹鮮葉APX活性的最佳條件 PVPP的加入量為鮮葉重的1.5倍,提取液 pH為7.8,反應液pH為7.0,底物AsA濃度為 0.5mmol/L。

注意事項:

(1)由于測定反應是通過測定反應底物AsA的降 低來計算APX活性,因此所加的酶量一般不宜過大 ,應使加液量控制在60s內,使產生的A290光值下 降呈良好的線性關系。

(2)由于此反應中AsA和H2O2量都很少,可以將 30%的H2O2稀釋500倍,在測定時直接吸取15?L的 H2O2與3mL反應液將加入到比色皿中,啟動反應。

(3)H2O2由于本身對AsA的氧化作用在測定時間 內可以忽略不計。

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酶制劑

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